Projekt

Der Tetracyclin Repressor (TetR) dient der Regulation des Gens für die Resistenz gegen das Antibiotikum Tetracylin in Bakterien. In Abwesenheit von Tetracyclin bindet TetR mit hoher Affinität an Operatorsequenzen der DNA. Die hochspezifische Bindung des Induktors Tetracyclin (Tc) führt zu einer Konformationsänderung in TetR, die zur Ablösung von der Operator-DNA führt und die Expression dahinter liegender Gene freigibt. Dieses Regulationssytem wird vielfach zur Funktionsanalyse von unbekannten Genen in der bakteriellen Postgenomik angewandt. Wir konzentrieren uns auf die Aufklärung mechanistischer Details des Regulationsvorgangs und die Verbesserung seiner Anwendung bei Bakterien. Ein Schwerpunkt der gegenwärtigen Arbeiten betrifft den Induktionsmechanismus, wobei wir den Ablauf der proteininternen Informationsübermittlung von der Bindung des Induktors bis zur geänderten DNA Bindung aufgeklärt wollen. Die Protein-Ligand Erkennung soll in die Beiträge der Tc-TetR Wechselwirkungen zur Affinität und Spezifität aufgelöst werden. Durch molekulare Evolution werden TetR Varianten mit neuen Induktorspezifitäten generiert und anschließend der Modus der Induktorbindung verglichen. Diese neuen Induktorspezifitäten stellen auch verbesserte Regulationswerkzeuge für die Genomik dar. Eine Reihe von TetR Mutanten zeigt einen reversen Phänotyp: Die Bindung an die Operatoren wird bei diesen Varianten nicht durch Tc verhindert sondern bedarf im Gegenteil der Anwesenheit von Tc. Durch vergleichende molekulargenetische und biochemische Analysen dieser Mutanten soll der dieser Funktionsumkehr zugrundeliegende molekulare Mechanismus ermittelt werden. Diese neuen Regulatorelemente sollen schließlich in verschiedenen Bakterien und zur gleichzeitigen, unabhängigen Regulation mehrerer Gene weiterentwickelt werden.

Publikationen:
Orth P., Schnappinger D., Phaik-Eng S., Ellestad G., Hillen W., Saenger W. and Hinrichs W.: Crystal Structure of the Tet Repressor in Complex with a Novel Tetracycline, 9-(N,N-dimethylglycylamido)-6-demethyl-6-deoxy-tetracycline. J. Mol. Biol., 285 (1999) 455-462
Schnappinger D., Schubert P., Berens C., Pfleiderer K., and Hillen W.: Solvens Exposed Residues in the TetR Four Helix Bundle Contribute to Subunit Recognition and Dimer Stability. J. Biol. Chem., 274 (1999) 6405-6410
Tiebel B., Radzwill N., Aung-Hilbrich L. M., Helbl V., Steinhoff H.-J., and Hillen W.: Domain Motions Accompanying Tet Repressor Induction Defined by Changes of Interspin Distances at Selectively Labelled Sites. J. Mol. Biol., 290 (1999) 229-240
Levy S. B., McMurry L. M., Burdett V., Courvalin P., Roberts M. C., Taylor D., and Hillen W.: Nomenclature for New Tetracycline Resistance Determinants. Antimicrob. Agents Chemother., 43 (6) (1999), 1523-24
Tebbe J., Orth P., Küster E., Hillen W. and Saenger W.: Chrystallization and Preliminary X-ray Analysis of Catabolite Control Protein A, free and in complex with its DNA-binding site. Acta Cryst. B., 56 (2000) 67-69
Sigler A., Schubert P., Niederweis M., and Hillen W.: Permeation of Tetracyclines through Membranes of Liposomes and E. coli. Eur. J. Biochem. 267 (2000) 527-534
Kintrup M., Schubert, P., Kunz M., Chabbert M., Alberti P., Bombarda E., Schneider S., and Hillen W.: Trp Scanning Analysis of Tet Repressor Reveals Conformational Changes Associated with Operator and Anhydrotetracycline Binding. Eur. J. Biochem. 267 (2000) 821-829
Vergani B., Kintrup M., Hillen W., Lami H., Piémont E., Bombarda E., Alberti Pl, Doglia S. M. and Chabbert M.: Backbone Dynamics of Tet Repressor a8Ça9 Loop. Biochemistry 10 (2000) 2759-2768
Scholz O., Thiel A., Hillen W. and Niederweis M.: Quantitative Analysis of Gene Expression with an Improved Green Fluorescent Protein. Eur. J. Biochem. 267 (2000) 1565-1570
Kunz M., Kintrup M., Hillen W. and Schneider S.: Conformational Changes Induced in the Tet Repressor Protein TetR(B) upon Operator or Anhydrotetracycline Binding as Revealed by Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy on Single Tryptophan Mutants Photochem. Photobiol., 72 (2000) 35-48
Orth P., Schnappinger D., Hillen W., Saenger W. and Hinrichs W.: Structural Basis of Gene Regulation by the Tetracycline Inducible Tet Repressor Operator System. Nature Structural Biology 7 (2000) 215-219
Saenger W., Orth P., Kisker C., Hillen W. and Hinrichs W.: The Tetracycline Repressor - a Paradigm for a Biological Switch. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 39 (2000) 2042-2052. Der Tetracyclin Repressor - das Musterbeispiel für einen biologischen Schalter. Angew. Chem., 112 (2000) 2122-2133
Tiebel T., Garke K. and Hillen W.: Observing Conformational and Activity Changes of Tet Repressor In Vivo. Nature Structural Biology 7 (2000), 479-81
Scholz O., Schubert P., Kintrup M. and Hillen W.: Tet repressor induction without Mg(2+). Biochemistry. 39 (2000) 10914-20
Schubert P., Schnappinger D., Pfleiderer K. and Hillen W.: Identification of a Stability Determinant on the Edge of the Tet Repressor Four-Helix Bundle Dimerization Motif. Biochemistry 40 (2001) 3257-3263
Scholz O., Kintrup M., Reich M. and Hillen W.: Mechanism of Tet Repressor induction by tetracyclines: Length compensates for sequence in the a8 - a9 loop. J. Mol. Biol. 310 (2001) 979-986
Hillen W. and Berens C.: Tetracyclin-gesteuerte Genregulation: Vom bakteriellen Ursprung zum eukaryotischen Werkzeug. Biospektrum 4 (2002) 355-358